铁√元素是个体生长、细胞代谢和免疫反应所ぷ必需的微量元素。铁稳态的失调与各种疾病的发生和发展息息相关：铁缺乏会导致宿主▃发育迟缓，而铁过载更易引发炎性反应, 还可能与癌症的发生发展密切相关。值得注意∩的是，小肠作为宿主体内铁的主要吸收场所，并不能完全々将食物中的铁吸收，而相当一部分铁在结肠中与肠道菌群发生密切的交互作用，并影响肠道菌群的生态系统，从而进一步调节宿主的健康和代谢。多项研究表明，铁失衡会导致肠道菌群的改变，进而改◣变微生物多样性，增加病原体丰度并诱导肠道炎症的发生发展。在近数十年的筛选研究中，研究人员尚未系统地研究铁与肠道◥菌群之间的关︻系，也缺乏无创、方便且精准评估组织中铁水平的方法。
2020年1月7日，广东省微生物研究所谢黎炜研︼究员所带领的肠道微生态与健康研究团队，在国际著名期刊The FASEB Journal 在线发表△题为“Fecal microbiota as a noninvasive biomarker to predict the tissue iron accumulation in intestine epithelial cells and liver”的研究〓论文，该研究团队构建了铁紊乱小鼠，结合机器学习算法可∩以精确地预测肠上皮细胞和肝●脏的铁水平，并可能作为一种无创方式用于铁代谢异常相关疾病的早期辅助诊断。目前相关◢研究成果已申请中国发明专利（专利号：201910309446）
结果一：饮食中¤铁水平的控制扰乱了系统性铁稳态
为了了解铁介导的肠道菌群调控机制，将6周龄的C57BL / 6J小鼠以AIN93G为基础＠的饮食喂养了12周，以诱↑导铁缺乏或铁超载（Fig.1）。通过对AIN93G、FeE和FeD小鼠体重、血红蛋白、血细胞比容及格组织器官中铁含量测定，结果表明：缺铁饮食会导致小鼠生长迟缓、血红◥蛋白和血细胞比容降低，缺铁饮食小鼠的十二指肠（SI）、肝脏（Liver）、BAT（棕色脂肪组♂织）、腹股沟白色脂肪组织（iWAT）的上皮细胞中的铁含▓量较CK和FeD显著降低。FeE饮食仅在SI和肝脏中导致铁超载，而在BAT和iWAT中未↓导致铁超载。通过粪便中测定的铁含量结果可以看出，未吸收的铁通过结肠，并排入粪便。与铁运输相≡关的基因，例如十二指肠中的Slc11a2，Slc40a1，Slc39a14和Tfr1以及肝↙脏中的Tfr1和Slc39a14，都差异㊣表达。
结果二：铁失调会严重干扰肠道菌群多样性和宏基因》组功能
在12周的∑喂食期后，收集了27个粪便样品并进行了细菌16SV3+V4多样性测序（Fig.2），对其№测序数据进行α-多样性、β-多样性、聚类热图分析，结果表明：饮食中不同的铁含量会显著改变肠道㊣ 菌群的组成。组间显著性╳差异LEfSe分析，LDA值> 2，确定了88个显著性差异的细菌。综上，铁可ξ能是肠道菌群组成的关键调节剂。
通过BugBase来了解肠道微生物多样性的改变是否会引起功能改变，并且在不同表型下的肠道菌群相对丰度是否有显著♂性差异。通过使用PICRUSt进行宏基因组功能预测来评估三组微生物群里之间的功能差异，可以看到铁水平的变化导致肠道微生物群落代★谢的适度变化，这是针对KEGG数据库的分析的。与FeD组相比，高铁饮食喂养☉的小鼠的肠道中存在的类群中的脂肪酸代谢，酪氨酸代谢和糖异生稍高。亚油酸代谢，β-丙氨〓酸代谢，柠檬烯和pin降解途径适度改变。此外，随着整个PICRUSt数据※的降维，二维空间分析表明AIN93G与其他两组显著不同∑（FeD P = .0056，FeE P = .03），并证明饮食〓引起的微生物群失调扰乱了肠道微生物群代谢的平衡▓。
结果三：肠道菌群的改变与饮食中的铁含量和铁相关的生理参数密切相关
人们普遍认为←，环境变化可能会对肠道菌群的功能和病理生理产生巨大影响，例如刺激，遗传和其他因素Ψ 。尽管针对性的饮食会●显著扰乱小鼠的生理生化指标，但不同处理组之间肠道╲菌群的差异是否与这些生理生化★指数的变化有关仍是未知的。因此，本研究进行了RDA分析，以评估铁相关的生理〒生化指标和肠道菌群之间的关系。结果表明（Fig.3），可以使用六个环境因素来解释26.72％的方差，这表明铁水〖平可以在门水平显著改变肠道菌群的变化，三组样品可清晰地分开。根据蒙卐特卡洛排列测试，生理参数，例如血红蛋白（P = .004），血细胞比容（P = .004），SI铁含量（P = .006）和粪便铁含量（P = .023）很高约束排序模型中与细菌类』群的分布相关。为了进一步确认RDA分析，基于Bray Curtis距离，ANOSIM还显示了组间的差异比组内的差异更显著（R = 0.537，对于P <.0001）。RDA和ANOISM分析均证明膳食铁元素的多少在每组样品的分离和聚集中起着↘至关重要的作用。
结果四：补铁扰动肠道微生物群落网卐络
为了确定铁是否可以影响肠【道菌群群落网络，本研究使用了图论算法并进行了共现分析。根据Spearman的相关性，针对共现网络作图的物种分别表明，三组之间的微生物Ψ 群落有显著差异（abs（r）> 0.6，P <.05，支持信「息表：共现分析）。通过使用贪婪聚类方法，FeD，AIN93G和FeE组分别细分为六个，五个和五▃个子社区（Fig.4）。在这个网络图中，铁的存在可以⊙重组网络，表明饮▆食中铁的含量可能存在阈值。如多样性分析所示，此阈值可能是影响群落结构的决定因素。
结果五：用随机∞森林法鉴定与全身铁失调有关╲的关键细菌
本研究前面已经证明铁调节宿主的生理ㄨ和代谢平衡，也显ζ 著影响微生物群落的结构。不同铁水平的饮食会导致120个细菌【的相对丰度发生显著变化（Kruskal非参数检№验，P <.05）。因此，很难区分它们的重要性。因此，使用随机森林算法来识别三组响应系统性铁失调的特征○性菌群。通过对随机森林模型进行五重交叉验证，选择了前5个细菌作为应对铁介导的系统失调的主要分类单元（Fig.5B）。这些包括卟啉单胞菌（V19），梭状芽孢杆菌（C83），粘液梭菌（V143），产气荚膜梭菌（V70）和梭状梭菌（V63）。这五个关键类群与生理参数显著相关（Fig.5C）。给定五个微生¤物群落在社区中的关键位置，以卐应对系统性铁失调，基于它们的相对丰度建立了一个预测模型，以识别々目标样品。ROC曲▆线表明可以很好地区分样品，其AUC值分别为99.4％，88.9％和100％（Fig.5D-F）。
结果六：基于肠道菌群的相对丰度对全身铁状态☆的预测
随机森林分类器根据系统性铁的变化确定了五个关键分类单元，这五个关键分类单元与铁相关的生理参数之间具有很强的相关性。为了推测肠道菌群的相△对丰度是否可以用作预测组织铁含量的生物标记。本研究构建了LASSO回归模型，该模型可以帮助选择最№佳的独立参数。使用LASSO回归模型中的lambda（λ），确定了关键分类单元，以建立每个环境因子的预测模型（Fig.6A，D）。利用这些模型预测SI，肝脏和粪便中铁的含量以及血红蛋白的R2分别为99.7％，96％，65％和67％（图6B，E）。最重要※的是，SI和肝脏中的铁含量可以高度预测。使用包括随机森林和LASSO回归模型在内的两个机器学习模型，将两个模↑型中的关键分类单元合并以用作关键分类单元来预测SI和肝脏种铁的含量（Fig.6C，F）。
结论
铁在氧气运输，新陈代谢和免疫防御中起着基本作用。在人类中，小肠每天吸收2至3 mg铁，其余的铁进入结〗肠，由肠道菌群利用。但是，粪便和全身性铁水平如何影响肠道菌群的体内平衡，仍然未知。为了了解铁对肠道菌群的◤影响，收集了C57BL / 6J小鼠的粪便样品■，并评估了它们的微生物多样性★和宏基因组功能。在本研究中，已经表明饮食中的铁□水平是导致肠道菌群改变的关键因素。最重要的是，基于机器学∮习算法，建立了预测模型，该模型有助于识别关键分类单元以应对系统性□ 铁质挑战。通过利用这些新发现的生物标记，可以准确预测小肠和肝脏中的铁含量，R2分别为99.7％和99.6％。这些发现提供了有关系统性铁稳态与肠道功能之间联系的精确信息。
